大神们都在研究的外泌体是什么？
发布时间：2016-4-15
外泌体是包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)。 所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。 有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制则刚刚开始研究。 外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。无论是对其功能，还是对如何将其用于微创诊断的开发的研究都日益增长。
功能
研究发现外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。外泌体具有脂质双层膜结构，能很好的保护其包被的物质，且能靶向特定细胞或组织，因此是一种很好靶向给药系统（targeted delivery system）。
具体功能：
•有助于细胞成熟过程中等离子体膜蛋白的移动
•传递大分子信息(RNA和蛋白质)，使细胞间信息传递
•促进免疫反应、抗原呈递、程序性细胞死亡、血管生成、炎症反应、凝聚
•肿瘤细胞分泌的外泌体可促进致癌基因的传播
•在极性产物的生长和分化期间形成转运蛋白
•朊病毒等病原体的传播以及病毒的细胞间传播
•通过分泌化学诱导信号帮助网柄菌细胞迁移
•母乳中包含miRNA的外泌体，有助于增强婴儿免疫系统
exosome的分离
早前发表的一些研究主要是从淋巴细胞、胚胎干细胞以及血清、唾液和母乳中提取出exosome并回收RNA，再利用qRT-PCR和新一代测序来进行鉴定和分析。它们在分离时往往是采用超速离心的方法。这的确是一种经典的方法，能制备出干净的exosome。
但是，缺点也不少：
传统分离方法缺点：
耗时耗力，往往需要8-30个小时；
每次最多只能处理6个样品；
需要大量的起始材料；
产量不高。
最重要的是——你得有台超速离心机，还要有丰富的经验。
如果有个试剂盒，像提质粒那样轻松地提取出exosome，那就再好不过了。
赛默飞世尔公司旗下Invitrogen品牌推出了多款总exosome提取试剂盒，能分别从细胞培养基、血清、血浆、尿液及其他体液中分离完整的exosome。与超速离心相比，这种方法实在是简单省事多了。
试剂盒原理
这种试剂通过捆绑水分子，将溶解度不太高的组分（如囊泡）挤出溶液，从而可通过常规离心来收集。样品先经过2000xg 30分钟低速离心以去除细胞碎片，根据样品类型加入指定比例的提取试剂并混匀，并在2-8°C孵育一定时间（血清样品只需4度孵育30分钟，培养基上清则需孵育过夜），然后通过常规离心（10,000 x g，10-60分钟，因样品类型而异）即可回收exosome沉淀。其中手动操作部分仅需15-20分钟，甚至比提质粒还简单。之后用PBS或类似溶液重新溶解沉淀。这下，exosome可立即用于下游分析或进一步的纯化啦。
试剂盒效果
赛默飞的平行比较试验结果显示，试剂法与超速离心法提取出的exosome相当。在NanoSight® LM10仪器上分析的图谱显示，所有囊泡均小于300 nm，且大部分处于exosome的典型大小范围30-150 nm（图1）。
图1. 从HeLa细胞培养基中回收的Exosome的分析。(A) 采用总Exosome提取（从细胞培养基中）回收的Exosome的大小分布与 (B) 采用传统的蔗糖密度梯度超速离心实验方案提取的Exosome相当。
进一步处理总exosome——分离亚群
在获得了总的exosome之后，您还可以通过磁珠提取出高纯度的亚群。例如Dynabeads®磁珠可捕获表达CD63的exosome，用于下游的流式细胞仪、电镜或Western blotting分析。超顺磁的Dynabeads呈浅棕色，因此在整个操作过程中您都可以“查看”您的样品。此外，样品量和磁珠量也能轻松调整。当然，您也可以不选CD63，而通过生物素化的抗体和链霉亲和素试剂来富集您感兴趣的亚群。
完整exosome的分析
分离过程结束后，您可能想要观察和确认一下这些小囊泡。不过，exosome的观察还真不简单，因为它们太小了。目前，研究人员多借助以下工具和方法。
在收集到exosome之后，我们可利用NanoSight® 仪器来分析囊泡的大小范围和浓度。这款仪器根据Stokes-Einstein 原理，将每一个进行布朗运动的颗粒直径计算出来。它既提供直接实时的纳米颗粒观察，也给出全面的颗粒粒径分布分析。
若没有NanoSight，那也没关系。通过RNA或膜组分的标记，我们也能在显微镜下观察exosome。赛默飞还提供了专门的Exosome离心柱（MW 3000），能够快速去除未掺入的染料。同时，这些离心柱也能用于缓冲液交换，或去除低分子量的杂质，如盐、核苷酸和小的寡核苷酸。此外，经过Dynabeads®磁珠富集的亚群可直接用于电镜和流式细胞仪（图2）。
图2. 利用流式细胞仪观察CD63+ Exosome。Exosome结合至包被有CD63（A和B）的乳胶微球或包被有生物素化的CD63（C和D）的Dynabeads® 链霉亲和素上，并进行CD63-PE染色。FSC/SSC (1,500次)和荧光直方图如图所示。
exosome货物的分离与分析
核酸与蛋白的分析对于许多研究人员来说已经是驾轻就熟了。赛默飞的总Exosome RNA和蛋白分离试剂盒能够从同一样品中分离蛋白和总RNA。试剂盒的标准化操作为实验带来可重复的结果。此外，您也可以通过Exosome免疫沉淀试剂盒，借助Dynabeads®磁分离技术来温和地分离出完整的exosome蛋白复合物。
这之后，就等你大显身手了。无论是利用Western blot来分析exosome蛋白，或是利用qRT-PCR或RNA-seq来分析RNA，exosome这种信号传导的新途径无疑将为您揭开一个新的研究篇章。
exosome这些迷人的小卡车，每天兢兢业业地在细胞之间穿梭，传递着重要的讯息。尽管这还是个年轻的研究领域，但有了不断上市的新工具，相信我们对exosome的了解会更加深入，更多exosome的秘密将会揭开。
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